Ensayos de Expresión y Análisis Genómico de iPSC y Músicos de Modelos de ELA
Cumplimiento Ético
Todos los procedimientos experimentales con ratones se realizaron de acuerdo con las pautas aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Academia Sinica (número de protocolo 13-06-559 y 23-07-2022).
Cultivo de iPSC Humanas
Se adquirió la línea mutante de iPSC de ELA SOD1+/L144F (femenina) y una línea de control sana del Harvard Stem Cell Institute iPSC Core Facility. Las líneas TDP43G298S (masculina), C9ORF72exp (masculina), una línea de control isogénica de C9ORF72exp, y líneas de iPSC de ELA esporádica (masculina) se adquirieron del proyecto Answer ALS de Cedars-Sinai. Las células se mantuvieron en condiciones de Essential 8 (Life Science) sin alimentación y se subcultivaron mediante tratamiento con 0.5 mM EDTA. Estas se cultivaron en atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C. En este estudio no se evaluó la influencia del sexo; más bien, se comparó el efecto del tratamiento CPA entre líneas isogénicas; el tratamiento con FB23-2 se utilizó para rescatar líneas de iPSC de ELA y se comparó con el control de vehículo.
Diferenciación y Ensayo de Supervivencia de iPSC-MNs
Las iPSCs humanas fueron diferenciadas en MNs usando un protocolo mejorado. En el día 0, las iPSCs se disociaron en células individuales usando accutase (Gibco). Luego, 1.5-2 × 105 células fueron resuspendidas en 10 mL de medio N2/B27. Después de dos días de diferenciación, se introdujeron dosis adicionales de ciertos compuestos durante el proceso. Una vez generados los MNs, estos fueron mantenidos en medio de cultivo de MN y se cambiaron cada tres a cinco días.
Tratamientos de Inhibidores de FTO
Para acelerar la degeneración de MN, el medio de cultura de MN fue reemplazado con medio N2/B27, y se añadió CPA para acelerar la degeneración. FB23-2 se utilizó en combinación con CPA durante 15-30 días. La degeneración se evaluó mediante inmunostaining de SMI32 y análisis de imágenes.
Cuantificación de la Degeneración de Neuritas
Las imágenes tomadas de regiones seleccionadas fueron cuantificadas usando métodos de análisis de imágenes automatizados. La extensión de la degeneración de neuritas se expresó como un índice de degeneración (DI). Se asociaron calibraciones de intensidad de gris y se utilizaron algoritmos de análisis de partículas de ImageJ para determinar el área de neuritas fragmentadas.
Cuantificación de Methylación de m6A
La extracción del ARN total se realizó utilizando Trizol. La cuantificación de la methylación de m6A se llevó a cabo con un kit específico, utilizando lecturas de absorbancia.
Ensayo Dot Blot de m6A
El ARN total fue aislado y purificado a partir de mRNA. Posteriormente, se realizó un ensayo de dot blot utilizando anticuerpos específicos para detectar m6A.
Cruces de Ratones
Se utilizaron ratones portadores del transgén humano mutante SOD1G93A comprados en el Laboratorio Jackson. Otras líneas de ratones se criaron para obtener ratones de tipo salvaje y knockout condicional.
Inmunostaining
Los cortes de la médula espinal de los ratones adultos fueron permeabilizados e incubados con anticuerpos primarios y secundarios, seguido por el montaje en Aqua-Poly/Mount.
Análisis de Neuronas Motoras Espinales
Se contaron los MNs ChATon en los cuernos ventrales lumbares para evaluar la cantidad de MN en varias secciones.
Análisis de Supervivencia
Los ratones fueron monitoreados semanalmente hasta que se definieron como el punto de finalización de la enfermedad.
Análisis de NMJ
Las uniones neuromusculares (NMJs) se visualizaron en músculos de montajes completos y se cuantificaron usando umbrales y software de análisis de imágenes.
Ensayos de Comportamiento
Se evaluó la actividad locomotora de los ratones a través de diversas tareas de comportamiento, incluyendo la prueba de campo abierto y rotarod.
Análisis de RNA y ATAC de Núcleos Únicos
Luego de la recolección de núcleos, se prepararon bibliotecas para la secuenciación y se analizaron utilizando herramientas específicas, obteniendo un profundo conocimiento sobre la dinámica de la expresión génica en diferentes condiciones.
Conclusiones
Los resultados de los estudios de expresión y análisis genómico ofrecen perspectivas sobre el desarrollo de tratamientos y comprendidos sobre la ELA, proporcionando un enfoque innovador en la investigación.
Este artículo destaca el compromiso con el cumplimiento ético y la ciencia responsable en el estudio de enfermedades complejas.
